Массив из множества микроскопических «лунок» на поверхности геля, каждая из которых содержит в себе анализируемую клетку.
Под воздействием электрического поля клетки, помещенные в гель, начинают перемещаться, оставляя за собой след, напоминающий хвост кометы. Более яркие и длинные «хвосты» принадлежат клеткам с наибольшей степенью повреждения ДНК.
Наша ДНК постоянно находится под угрозой, исходящей от радиации, ультрафиолетовых лучей, загрязняющих веществ в нашей пище и окружающей среде. Все эти факторы могут наносить ущерб нашему генетическому материалу, что приводит к возникновению рака и других болезней.
Анализ повреждений ДНК имеет решающее значение для понимания природы этих заболеваний и поиска новых методов лечения, однако в настоящее время методы обнаружения повреждений ДНК требуют утомительной и трудоемкой работы. Однако группа биоинженеров из MIT разработала новый способ быстро выявить повреждения ДНК в разнообразных условиях, обещая сделать такой анализ обычным методом при скрининге препаратов и эпидемиологических исследованиях воздействия факторов окружающей среды.
Предложенная методика основана на тесте 30-летней давности, известном как «метод ДНК-комет» (Comet assay). Этот тест назван так из-за напоминающей комету формы мазка, который образует поврежденная ДНК. Но в отличие от традиционного метода, с помощью новой технологии можно анализировать гораздо большее число клеток и делать это значительно быстрее.
Данная технология может предложить эпидемиологам новый подход к обнаружению опасных воздействий окружающей среды задолго до того, как они станут причиной рака, врачам — пути улучшения способов лечения рака, а исследователям фармацевтической промышленности — способы поиска новых лекарственных препаратов и выявления опасных наркотиков.
«Важнейшей особенностью нашей технологии является то, что она может быть использована для обнаружения генотоксических (вызывающих мутации) веществ в окружающей среде при помощи самого простого исследовательского оборудования», говорит Бевин Энгельворд (Bevin Engelward), доцент кафедры биоинженерии и один из соавторов работы.
Генотоксичность, то есть повреждающее воздействие того или иного соединения на геном, и канцерогенность - связанные явления. Метод ДНК-комет позволяет оценить степень повреждения геномной ДНК как в эксперименте, в научных целях, так и при решении практических задач: оценке влияния окружающей среды или условий труда, контроле трансплантационного материала при размораживании, в тканевой инженерии. Повреждение ДНК, выявленное тестом ДНК-комет, может свидетельствовать и о предрасположенности к онкологии, и об изменениях, связанных с ней. Увеличение выявляемых ДНК-комет повреждений ДНК характерно для опухолевых клеток . И, хотя за десятилетия с момента разработки, метод получил распространение только в специализированных областях, он может найти применение в диагностике и мониторинге лечения различных заболеваний . Преимуществами ДНК-комет является чувствительность, невысокие требования к количеству материала, быстрый в исполнении протокол работы, относительная простота и невысокая стоимость .
Метод ДНК-комет применяется для исследования различных типов клеток, как в культуре, так и в образцах биологических жидкостей и тканей . Главным требованием для проведения анализа ДНК-комет является перевод клеток ткани суспензию, поэтому при вскрытии лабораторных животных изъятые фрагменты органов должны пройти соответствующую обработку, а клетки, содержащиеся в крови или сперме можно исследовать напрямую . 80% злокачественных новообразований имеют эпителиальное происхождение. Эпителии, подвергающиеся и внешнему воздействию, и воздействию со стороны внутренней среды организма наиболее подходят для оценки генотоксичности методом ДНК-комет . Неинвазивным способом получения эпителиальных клеток человека является мазок эпителия ротовой полости и отбор эксфолиативного материала эпителия слёзного канала. Клетки эпителия ротовой полости живут 10-14 дней, присутствие в них повреждённой ДНК свидетельствует о недавнем воздействии генотоксического соединения. Исследования целостности ДНК эпителия ротовой полости могут помочь при мониторинге воздействий веществ, связанных с профессиональной деятельностью и пищевых продуктов .
Клетки, помещённые в агарозу на стекле, обрабатываются лизирующим раствором, и, если необходимо, ферментами, специфичными к определённым нарушениям. Разделение проводится в щелочном буфере. ДНК выходит из клетки и движется на анод, образуя шлейф, который можно увидеть, используя флуоресцентный микроскоп. Чем больше разрывов происходит в ДНК, тем более выражено движение её фрагментов. После процедуры стёкла нейтрализуются и окрашиваются интеркалирующими красителями для визуализации ДНК. Оценка электрофоретической подвижности ДНК проводится с помощью флуоресцентного микроскопа . Когда практически вся ДНК клетки фрагментирована, это, как правило, погибшая клетка. Если единичные клетки имеют такую степень повреждения генома, они исключаются из анализа .
Наиболее часто используемый щелочной протокол ДНК-комет (разделение при pH > 13) позволяет выявить одноцепочечные разрывы, сшивки в ДНК и между ДНК и белками . Использование в ходе пробоподготовки обработки щёлочью повышает восприимчивость метода, поскольку большинство генотоксических агентов не вносят двуцепочечного разрыва в цепи ДНК, а формируют одноцепочечные разрывы или участки с повышенной чувствительностью к щелочам . Дополнительно применяются ферменты, вносящие разрывы в области ДНК со специфическими поврежденими. Формамидопиримидин ДНК-гликозилаза разрезает цепи ДНК в области окисленных нуклеотидов, формамидпиримидинов (аденина и гуанина с открытым кольцом) и других производных гуанина; OGG1 выявляет окисленные пурины и формамидопиримидины, эндонуклеаза III выявляет окисленные пиримидины, T4 эндонуклеаза V распознаеё димеры пиримидинов, 3-метиладенин ДНК гликозилаза II (AlkA) специфична к 3-метиладенину; а урацил ДНК гликозилаза выявляет ошибочно встроенный в ДНК урацил . Такие протоколы обработки материала могут понадобится для решения специфических задач, например в замороженных тканях возрастает содержание окисленных пиримидинов и сайтов T4 эндонуклеазы V, а других нарушений не наблюдается. Метод ДНК-комет с обработкой соответствующим ферментом, может применяться для оценки состояния трансплантата перед пересадкой.
Одна из сфер клинической диагностики, в которой применяется технология ДНК-комет - диагностика мужского бесплодия. В силу устройства сперматозоида, риск нарушений структуры ДНК в этих клетках повышен, а системы репарации полностью не компенсируют происходящие нарушения. При мужском бесплодии наблюдают повышенную степень повреждения ДНК сперматозоидов. Количество разрывов ДНК в сперматозоидах в норме достигает ∼10 6 - 10 7 на геном, как у человека, так и у лабораторных мышей, что гораздо выше количества разрывов генома в лимфоцитах или клетках красного костного мозга. Оплодотворение сперматозоидом, содержащим повреждения ДНК, активирует в ооците процессы репарации, восстанавливающие эти повреждения, но риск мутаций и врождённых заболеваний у ребёнка при этом повышается. Частота невынашивания беременности коррелирует со степенью повреждения ДНК сперматозоидов. С этим связана повышенная частота врождённых заболеваний и нарушений развития у детей при ИКСИ .
Метод ДНК-комет применяется не только для оценки состояния ДНК, но и для исследования процессов репарации в клетках. При этом исследуемые клетки разрушаются, а полученным гомогенатом обрабатывается ДНК, в которую предварительно вносятся повреждения определённого типа, в смесь добавляются нуклеотиды и АТФ, необходимые для репарации. По способности гомогената восстанавливать те или иные повреждения судят об активности систем репарации в клетках. Тип повреждения, который вносится в ДНК, зависит от того, какой механизм репарации исследуется. Например, для оценки эксцизионной репарации оснований применяют повреждённую светом ДНК, содержащую 8-оксогуанин, а эксцизионной репарации нуклеотидов - облучённую ультрафиолетовым светом ДНК, содержащую димеры пиримидинов. Одноцепочечные разрывы вносятся обработкой перекисью водорода, облучением рентгеновскими или гамма лучами, алкилирование ДНК проводится путём обработки метил-метансульфонатом. Для исследования эксцизионной репарации нуклеотидов используют оценку накопления разрывов ДНК при блокировании полимераз, участвующих в этом процессе с помощью афидоколина, или цитозин арабинозида в сочетании с гидроксимочевиной .
Анализ экспрессии генов, ассоциированных с репарацией, не всегда может быть объективным показателем состояния ДНК в клетках, поэтому метод ДНК-комет позволяет получить ценную дополнительную информацию. Повышенная активность систем репарации свидетельствует не только о том, что клетки более устойчивы к повреждениям генома, но и о том, что они подвергаются воздействию генотоксичного агента, в результате чего синтез белков, участвующих в репарации, активирован. Внесение в рацион Q10, витамина С в медленно растворяющихся капсулах, повышает активность эксцизионной репарации оснований. Сходный эффект наблюдается, если вместо препаратов использовать богатые антиоксидантами фрукты и овощи. При этом снижается активность системы эксцизионной репарации нуклеотидов, поскольку в ней отпадает необходимость .
Тест микронуклеусов является прямым показателем канцерогенности, руководство ICH рекомендует использовать его в сочетании с ДНК-комет . Метод ДНК-комет можно сочетать с флуоресцентной гибридизацией FISH, чтобы определить, затрагивают ли изменения определённые участки генома . Для анализа большого количества шлейфов ДНК, полученных в результате процедуры ДНК-комет. рекомендуется применять автоматизированные решения. Это позволит снизить субъективность оценки и более точно оценить размер и форму образовавшихся шлейфов, что особенно важно с учётом необходимости сбора данных по большому количеству шлейфов в каждом препарате. ДНК-комет может применяться в качестве метода для клинической диагностики и в исследовательских целях - для оценки генотоксичности того или иного соединения.
- Kang SH, Kwon JY, Lee JK, Seo YR. Recent advances in in vivo genotoxicity testing: prediction of carcinogenic potential using comet and micronucleus assay in animal models / J Cancer Prev. - 2013. V.18, N.4. - P. 277-88.
- Rojas E, Lorenzo Y, Haug K, Nicolaissen B, Valverde M. Epithelial cells as alternative human biomatrices for comet assay / Front Genet. - 2014. V5. N. 386.
- Azqueta A, Slyskova J, Langie SA, O"Neill Gaivão I, Collins A. Comet assay to measure DNA repair: approach and applications / Front Genet. - 2014. - V.5, N.288.
- Aitken RJ, Bronson R, Smith TB, De Iuliis GN. The source and significance of DNA damage in human spermatozoa; a commentary on diagnostic strategies and straw man fallacies / Mol Hum Reprod. - 2013. - V.19. N.8. - P. 475-85.
Оценка воздействия гамма-лучей на ДНК лимфоцита с помощью метода ДНК-комет. Микрофотографии (А) и обработанные изображения (В).
Wang Y, Xu C, Du LQ, Cao J, Liu JX, Su X, Zhao H, Fan F-Y, Wang B, Katsube T, Fan SJ, Liu Q. Evaluation of the Comet Assay for Assessing the Dose-Response Relationship of DNA Damage Induced by Ionizing Radiation / Int. J. Mol. Sci. - 2013. - V.14. N.11. - P.22449-22461.
Воздействие перекиси водорода на ДНК сперматозоидов моллюска Choromytilus chorus
Lafarga-De la Cruz F., Valenzuela-Bustamante M., Del Río-Portilla M., Gallardo-Escárate C. Genomic Integrity evaluation in sperm of Choromytilus chorus (Molina, 1782) by comet assay / Gayana. - 2008. - V.72. N.1. - P.36-44.
Статья на конкурс «био/мол/текст»: Вы знаете, что изучением комет занимаются не только астрономы, но и молекулярные биологи? Их работа связана с космосом лишь косвенно. На кометы они смотрят в микроскоп. Звездным небом служит гель-слайд - микроскопическое предметное стекло, покрытое агарозой с исследуемыми клетками. Такое стало возможным благодаря открытию в 1984 году способа анализа ДНК, названного методом ДНК-комет.
О популярности в цифрах
Рисунок 2. Примеры повреждений ДНК, возникающих в результате действия факторов разной природы
Как видите, «разбойники» могут совершить огромный спектр «преступлений» и нанести существенный урон целостности ДНК. Однако в клетке на страже безопасности ДНК стоят системы репарации , «лекари», которые исправляют повреждения молекулы с помощью специальных «медикаментов» - ферментов, способных «залатать раны», нанесенные генотоксикантами. Ферментов репарации великое множество. На сегодняшний момент известно, что в эксцизионной репарации повреждений ДНК, т.е. в операциях, когда участок сначала вырезается, а потом собирается вновь, принимает участие 13 ферментов !
Однако не все так гладко, как кажется на первый взгляд. Операции в «отделении репарации» не всегда завершаются благополучно, т.е. восстановлением исходной молекулы ДНК. Итогом работы восстановительных систем могут стать и новые повреждения. Причина тому - весьма плотная упаковка нитей ДНК в ядре .
А что же ученые? Они выступают в роли «полицейских», которым нужно выявить «состав преступления», т.е. найти «преступника» и его «сообщников» (определить генотоксиканты, их дозы и концентрации) и установить тяжесть «преступления» (выявить степени повреждений ДНК). Именно в таких ситуациях помогает метод ДНК-комет.
Родом из Швеции
Попытки, направленные на изучение ядерных структур клетки и количественное определение нитевых повреждений ДНК в одиночных клетках организмов, были предприняты еще в 80-х гг. XX века такими учеными, как Кук и Бразелл , Ридберг и Йохансон . Однако лишь в 1984 г. шведские исследователи Остлинг и Йохансон развили новый метод определения повреждений ДНК . Именно они заметили, что изображения фрагментов ДНК, мигрировавших в электрическом поле, напоминали астрономические кометы. Сходство было налицо. «Кометы», полученные учеными из Швеции, обладали главными характеристиками космических «собратьев»: они имели «голову» и «хвост» . Отсюда и пошло такое романтическое название - метод ДНК-комет.
У метода есть еще ряд наименований - гель-электрофорез одиночных (изолированных) клеток и электрофорез в микрогеле . Первое название некорректно отражает суть анализа. Электрофорез проводится не в одиночных клетках, а в агарозном геле, где от одного полюса к другому движется ДНК, выделенная из этих самых клеток. Второе - верное, т.к. электрофорез осуществляется в агарозном геле, нанесенном на слайды. Но и этот термин не прижился. Указанные названия не пользуются большой популярностью и используются редко, в отличие от «метода ДНК-комет».
Заклинание для получения «комет»
Рисунок 3. Строение «кометы».
Лабораторные «кометы» - объекты интересные. Их облик напрямую зависит от факторов воздействия, их силы и условий проведения анализа. Информация о «кометах» не тайна, покрытая мраком, поэтому про их состав, строение и образование известно практически все.
В публикации 1984 г. шведы Остлинг и Йохансон назвали ДНК, которая мигрировала, - «хвост», а оставшуюся в полости ДНК - «центр» . Сейчас же практически ничего не изменилось: у «кометы» условно выделяют «голову» и «хвост» (рис. 3).
Надо четко представлять, что «комета» образуется не из клетки живого организма, а именно из ее ДНК. Помещенная в агарозный слой суспензия клеток образует полости, которые в процессе лизиса занимает ДНК этих клеток. Все дальнейшие манипуляции в методе ДНК-комет осуществляются именно с ДНК.
«Кометы» образуются в процессе миграции (перемещения) ДНК в электрическом поле (когда есть ток и напряжение). Что же происходит во время лизиса и электрофореза ? Более маленькие биомолекулы, входящие в состав клетки, «убегают» в лизирующий раствор в процессе диффузии, в отличие от ДНК, которая из-за своего чрезвычайно большого размера не может сдвинуться с места . Когда же слайды с ДНК подвергают электрофорезу, неповрежденная ДНК формирует «голову кометы», а поврежденные части молекул начинают «пробежки» по направлению к положительно заряженному источнику тока - аноду (т.к. ДНК заряжена отрицательно), образуя «хвост». Чтобы увидеть получившиеся «кометы», их окрашивают флуоресцентными красителями (бромистый этидий, акридиновый оранжевый и др.), а затем визуализируют с помощью флуоресцентного микроскопа на большом увеличении (рис. 4).
Остлинг и Йохансон пишут следующее: «Когда клетка встраивается в гель, она формирует углубление в нем. После лизиса клетки ее ДНК занимает это углубление. Большинство других биомолекул легко диффундирует по агарозному гелю. Таким образом, практически все они выходят из углубления, оставленного клеткой, в лизирующий раствор. Единственное исключение составляет ДНК, которая за счет своей большой молекулярной массы остается в геле» . - Ред.
Рисунок 4. Последовательность этапов метода ДНК-комет (начиная сверху по часовой стрелке). * - Этап необходим только в щелочной версии метода (рН > 13,0), чтобы нейтрализовать щелочь NaOH.
Чем сильнее повреждения ДНК (а степень повреждения зависит от дозы мутагена), тем более выражен «хвост кометы». Как вы уже поняли, длинный «хвост» - это не очень хорошо.
Универсальный солдат
Метод ДНК-комет - инструмент широкого профиля. С его помощью ученые «раскрывают преступления», связанные с покушением на здоровье человека и безопасность окружающей среды (конечно же, все это через исследование поврежденной ДНК). Метод приобрел такую популярность благодаря привлекательным характеристикам - простоте, скорости, экономичности и достаточно высокой чувствительности, которая позволяет выявлять повреждения ДНК, вызванные даже факторами низкой интенсивности (например, малыми дозами радиации). Среди множества способов оценки повреждений ДНК метод ДНК-комет является одним из самых подходящих в этой области. Помимо указанных выше преимуществ, он выигрывает, например, у широко известных цитогенетических методов (ана-телофазный , метафазный анализы , микроядерный тест ), еще и по другим веским причинам .
Метод ДНК-комет позволяет работать с любыми содержащими ДНК клетками, в отличие от микроядерного теста, в котором чаще всего задействуют клетки крови или костного мозга. Если же ана-телофазный и метафазный методы ограничены в перечне определяемых хромосомных аберраций , то метод ДНК-комет предоставляет широкий спектр своих модификаций, благодаря которым исследователь может выявить самые разные повреждения ДНК: одиночные, двойные повреждения, щелочно-лабильные сайты, апоптоз и другие. Именно такие возможности делают его «универсальным солдатом» и прокладывают методу дороги в разные области научных исследований , :
- экологический мониторинг - оценка состояния окружающей среды по степени повреждения ДНК организмов, обитающих на исследуемой территории (как правило, сравнивают уровни повреждения ДНК особей с загрязненной и контрольной территорий);
- биологический мониторинг - изучение влияния питания и других внешних факторов среды на организм по степени повреждения ДНК, накоплению повреждений и репарации;
- генотоксические исследования фармакологических препаратов, новых и уже имеющихся химических веществ (бытовая химия, пестициды и др.);
- клинические исследования , направленные на дородовую диагностику на стадии внутриутробного развития, выявление предрасположенности к заболеваниям;
- оценка эффективности терапий при онкологических заболеваниях и ее контроль.
Изменения познаются в сравнении
Наблюдение за состоянием окружающей среды, т.н. экологический мониторинг , помогает исследователям выявлять происходящие в среде изменения и вовремя бить тревогу (особенно в аварийных ситуациях, например, на Чернобыльской АЭС в 1986 г. или на АЭС «Фукусима Дайичи» в 2011 г.). При загрязнениях среды метод ДНК-комет в сочетании с организмами-индикаторами приходится как нельзя кстати. Списки организмов, характерных для разных сред обитания и наиболее чувствительных к изменениям состояния среды, достаточно обширны и включают виды, начиная с бактерий Escherichia coli и водорослей рода Chlamydomonas и заканчивая высшими растениями (Lemna minor, Pinus sylvestris ), млекопитающими (Microtus oeconomus ) и, конечно же, человеком (рис. 5). В методе ДНК-комет задействуют, как правило, не организмы целиком, а их «составные части» - клетки, особенно чувствительные к изменениям факторов внешней среды, или ткани, из которых эти клетки можно получить. У животных обычно берут клетки крови: эритроциты и лимфоциты, гемоциты (аналоги эритроцитов у беспозвоночных), целомоциты (клетки, выполняющие иммунную функцию у дождевых червей); у растений - клетки меристемы, интенсивно делящейся ткани.
Примечание: В анализе повреждений ДНК можно использовать и целых особей, если они представлены одной клеткой, как, например, Chlorella vulgaris .
Рисунок 5. Примеры организмов-индикаторов, используемых для оценки состояния окружающей среды с помощью метода ДНК-комет.
сайты scuola-cucina.com, photosflowery.ru, 4pics.ru, kharkov-fish.ru.gg, 10-themes.com, worldartsme.com, sms.si.edu, wulovef.com, qygjxz.com, hdimagegallery.net, nhm.ac.uk, picstopin.com, functionalecology.org, akva-world.ru, moskvapark.naidich.ru, botany.natur.cuni.cz, rusrep.ru, animalsfoto.com, go-that.appspot.com, hdimagelib.com
Как метод ДНК-комет работает в данном случае? Ученые сравнивают степени повреждения ДНК организмов-индикаторов, обитающих на исследуемой (загрязненной) и контрольной (незагрязненной) территориях: подвергаемых воздействию загрязненной почвы, воды и др., и таких же, но живущих в обычных контрольных условиях, т.е. когда отсутствует воздействие изучаемого фактора либо оно незначительно. Оценку степени повреждения ДНК проводят и в лабораториях, в строго контролируемых условиях, когда есть выборка организмов, подвергнутая воздействию исследуемого фактора или группы факторов (радиации, металлов, пестицидов), и обязательно контрольная группа (не испытывающая этого воздействия).
Пример: 11 марта 2011 г. в результате сильнейшего в Японии землетрясения и последовавшего за ним цунами произошла серьезная радиационная авария на АЭС «Фукусима Дайичи». В 2014 г. японские ученые провели исследование. Они выбрали два участка, пострадавших в результате аварии: с высоким уровнем радиации (2,85 мкЗв/ч) и с низким (0,28 мкЗв/ч) в качестве контроля. У дождевых червей семейства Megascolecidae с этих участков проанализировали степень повреждения ДНК. Оказалось, что этот показатель достоверно выше у особей, подвергнутых воздействию высокого уровня радиации, чем у особей на участке с низким уровнем воздействия .
Сценарии могут быть разными. Степень повреждения ДНК в клетках может повышаться, снижаться или же оставаться неизменной. Повышенная степень повреждения ДНК у организмов с загрязненной территории может свидетельствовать о внутренних изменениях в функционировании клеток, которые приводят к многочисленным «поломкам» ДНК.
Примеры: Некоторые металлы, поступая в организм, индуцируют активные формы кислорода (АФК), вызывающие повреждения ДНК ; ионизирующее излучение способствует образованию свободных радикалов, также являющихся «обидчиками» ДНК. Действие ультрафиолетовых лучей может приводить к образованию димеров в ДНК , нарушающих связь двух ее цепочек и таким образом меняющих конформацию молекулы.
Снижение степени повреждения ДНК или отсутствие различий наталкивает на мысль, что организмы справились с «гнетом» генотоксикантов и приспособились к жизни в этих неблагоприятных условиях. Такое приспособление носит название адаптации. Но это совсем другая история.
Наследственность - страшная сила
Слышали о таких заболеваниях, как синдром хромосомных поломок (синдром неймегеновского повреждения), пигментная ксеродерма и трихотиодистрофия ? Они проявляются только тогда, когда оба родителя - носители дефектного гена (рис. 6).
В литературе есть данные о возможности применения метода ДНК-комет в диагностике этих наследственных заболеваний, что особенно важно на пренатальной стадии, т.е. при беременности.
Синдром неймегенского повреждения (Nijmegen breakage syndrome, NBS ) - заболевание, связанное с постоянными нарушениями целостности ДНК. Проблема заключается в том, что в гене NBS1 происходит мутация, которая «выключает» нибрин - белок, контролирующий восстановление парных разрывов ДНК, индуцируемых радиацией. Именно поэтому люди, страдающие этим синдромом, являются чрезвычайно радиочувствительными . Божена Новотна из пражского Института экспериментальной медицины в своем исследовании утверждает, что метод ДНК-комет отлично помогает выявить гетерозиготных носителей гена NBS1 по аномально высокому уровню повреждений нитей ДНК в «кометах» лимфоцитов .
Не менее опасными являются пигментная ксеродерма и трихотиодистрофия . Это серьезные заболевания человека, передающиеся по наследству. В первом случае при непродолжительном нахождении на солнце у детей на открытых участках кожи (кистях рук, шее, лице) сначала появляются красные пятна, которые впоследствии переходят в выраженную пигментацию вплоть до образования опухолей. Второе заболевание выражается в ломкости волос и ногтей, задержке в умственном развитии и аномалиях в строении черепа.
Эти заболевания объединяет нарушение в работе эксцизионной репарации нуклеотидов. По успешности эксцизионной репарации нуклеотидов в клетках плода с помощью метода ДНК-комет можно выявить, будет ли ребенок страдать этими заболеваниями. В литературе описаны случаи такой диагностики .
Перед исследователями стояла задача: до рождения выяснить, будут ли дети болеть пигментной ксеродермой и трихотиодистрофией. Эксперименты проводились в семьях, в которых родители являются носителями генов пигментной ксеродермы (семья Х ) и трихотиодистрофии (семья Y ) и уже имеют детей с этими заболеваниями .
Семья Х : беременность 15 недель, мать - носитель гена пигментной ксеродермы, есть ребенок 3-х лет с этим заболеванием.
Семья Y : беременность 10 недель, отец и мать - носители гена трихотиодистрофии, двое детей с трихотиодистрофией умерли в возрасте 22 месяца и 6 лет, еще один - в результате спонтанного аборта (выкидыша).
Все клетки в течение 45 минут подвергали действию ультрафиолетового излучения.
Исследование семьи Х : Уровень повреждений ДНК в клетках плода, определенный с помощью метода ДНК-комет, был близок к уровню повреждений ДНК в фибробластах матери-носительницы, т.е. соответствовал уровню нитевых повреждений в условиях нормальной работы эксцизионной репарации ДНК. Вывод - плод здоров. Этот вывод подтвердился после рождения нормального ребенка.
Исследование семьи Y: в клетках плода по сравнению с фибробластами отца и матери выявлен дефект в работе эксцизионной репарации, который был подтвержден и другим методом, не основанном на изучении репарации. Выявлено, что плод болен. После разговора с семьей было решено делать аборт.
Промышленность - враг здоровья человека
Здоровье людей, работающих на промышленных объектах или проживающих в экологически неблагоприятных районах, каждый день подвергается риску. Опасность заключается не только в ежедневном тесном контакте организма с генотоксикантами (ионизирующим излучением, тяжелыми металлами и другими химикатами), но и в вероятности аварийных ситуаций (примеры см. выше), последствия которых могут быть катастрофичны для организмов. Изменения состояния организма могут быть самыми разными, начиная с легких недомоганий вроде головной боли и заканчивая раковыми заболеваниями.
Метод ДНК-комет можно применять в качестве перспективного инструмента первичной оценки состояния генома людей, работающих или проживающих в экологически неблагоприятных условиях. Это означает, что ДНК-кометы можно использовать не только в перечисленных сферах исследований, но и применять в будущем в других областях, расширять варианты применения метода в клинических исследованиях, медицине и многом другом.
Примеры: В Польше в результате аварии на заводе по изготовлению батареек работники подверглись сильному воздействию свинца и кадмия, которое привело к незначительному, но достоверному повышению уровня повреждений ДНК по сравнению с группой людей, не испытавших такого стресса . Генотоксическое действие газосварочных аэрозолей, содержащих тяжелые металлы - марганец, хром, никель, кадмий, кобальт, свинец, молибден, железо, - на ДНК лейкоцитов выявлено для людей, чья работа в течение долгого времени связана со сваркой .
Есть и некоторые трудности
Чтобы правильно использовать метод ДНК-комет, нужно «знать в лицо» не только его возможности и достоинства перед другими методами, но и, конечно же, недостатки, ограничения и трудности, с которыми нужно быть начеку. Метод требует оптимизации лизиса, электрофореза и других условий в зависимости от типа клеток, которые использует ученый, и целей исследования.
Пояснение: клетки растений и животных требуют разных условий для высвобождения ДНК, т.е. лизиса. Из-за наличия целлюлозной клеточной стенки на лизис растительных клеток тратится больше времени, чем у животных.
Из первой трудности вытекает второе неудобство: адаптация метода к задачам анализа может быть очень трудоемким процессом (хотя сама методика проста и понятна), особенно если с объектом вашего исследования никто не работал по методу ДНК-комет. Бывает, «настройка» методики в таком случае требует очень много времени.
Иногда возникают сложности в интерпретации результатов, полученных по степени повреждения ДНК, поскольку степень повреждения не всегда удается соотнести с дозой фактора воздействия.
Пояснение: Такая проблема может быть связана с недостаточной оптимизацией метода, когда к одним типам повреждений примешиваются другие и искажают тем самым результаты. Вносить «смуту» в реальную степень повреждения ДНК могут и системы репарации, которые исправляют какую-то часть возникающих нарушений.
Одной из самых главных трудностей можно назвать сопоставление результатов , полученных с помощью метода ДНК-комет разными учеными в разных лабораториях и научно-исследовательских институтах. Для оценки повреждения ДНК используют методики с модификациями и абсолютно разные показатели (например, процент ДНК в «хвосте кометы» или длину «хвоста»).
Пояснение: Длина «хвоста кометы» - расстояние, на которое мигрировала ДНК от «головы» хвоста. Процент ДНК в «хвосте кометы» - это количество ДНК, мигрировавшей в «хвост», выраженное в процентах. С полным списком показателей оценки повреждения ДНК можно ознакомиться на сайте www.cometassayindia.org .
Активно предпринимаются попытки стандартизировать применение метода ДНК-комет, что поможет сравнивать полученные учеными результаты. Например, в генотоксических исследованиях разработаны протоколы и методические рекомендации .
Пояснение: В методических рекомендациях Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора четко определены тест-объекты (клетки человека) и подробно описаны все этапы анализа. Согласно данным рекомендациям, с помощью метода ДНК-комет проверять на генотоксичность можно товары бытовой химии и изделия из полимерных материалов.
Заключение
«Кто вооружен, тот защищен» - таков девиз работы с методом ДНК-комет. Знание достоинств и трудностей применения данного способа оценки повреждения ДНК позволяет мастерски манипулировать ходом работы, избегать «подводных камней» и получать корректные результаты.
Метод ДНК-комет играет роль «палочки-выручалочки» в оценке общего состояния организма, как правило, на ранних этапах воздействия неблагоприятных факторов среды. На начальном этапе именно повреждения ДНК являются самым быстрым и поэтому единственно доступным для измерения ответом организма на неблагоприятное воздействие еще задолго до появления изменений на физиологическом уровне.
Теперь вы знаете, как биологи получают «кометы» в лабораториях и зачем они им так нужны.
Литература
- Liao W., McNutt M.A., Zhu W.-G. (2009). The comet assay: A sensitive method for detecting DNA damage in individual cells . Methods . 48 , 46–53;
- Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции: учебник для студентов высших учебных заведений (3-е издание, перераб. и доп.). СПб.: Н-Л, 2015. - 720 с.;
- Piperakis S.M. (2009). Comet assay: a brief history . Cell Biol. Toxicol. 25 , 1–3;
- Ярмоненко С.П. Радиобиология человека и животных. М.: Высш. шк., 2004. - 549 с.;
- Cook P.R. and Brazell I.A. (1976). Characterization of nuclear structures containing superhelical DNA . J. Cell Sci. 22 , 303–324;
- Rydberg B. and Johanson K.J. Estimation of single strand breaks in single mammalian cells . In: DNA repair mechanisms / ed. by Hanawalt P.C, Friedberg E.C, Fox C.F. NY: Academic, 1978. P. 465–468;
- Ostling O. and Johanson K.J. (1984). Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells . Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 , 291–298;
- Cotelle S. and Ferard J.F. (1999). Comet assay in genetic ecotoxicology: a review . Environ. Mol. Mutagen. 34 , 246–255;
- Tice R.R., Agurell E., Anderson D., Burlinson B., Hartmann A., Kobayashi H. et al. (2000). Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing . Environ. Mol. Mutagen. 35 , 206–221;
- Филиппов Э.В. (2014). Использование метода «ДНК-комет» для детекции и оценки степени повреждений ДНК клеток организмов растений, животных и человека, вызванных факторами окружающей среды (обзор) . Наука и образование . 2 , 72–78;
- Collins A.R. (2004). The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations . Mol. Biotechnol. 26 , 249–261;
- Fujita Y., Yoshihara Y., Sato I., Sato S. (2014). Environmental radioactivity damages the DNA of earthworms of Fukushima Prefecture, Japan . Eur. J. Wildl. Res. 60 , 145–148;
- Barillet S., Buet A., Adam C., Devaux A. (2005). Does uranium exposure induce genotoxicity in the teleostean Danio rerio ? First experimental results . Radioprotection . 40 , 175–181;
- Каган М.Ю., Шулакова Н.С., Тумирова Р.А., Злодеева Е.А., Резник Н.В. (2012). Синдром Ниймеген (клиническое наблюдение) . Педиатрическая фармакология . 3 , 102–105;
- Alapetite C., Benoit A., Moustacchi E., Sarasin A. (1997). The comet assay as a repair test for prenatal diagnosis of Xeroderma pigmentosum and trichothiodystrophy . J. Invest. Dermatol. 108 , 154–159;
- Palus J., Rydzynski K., Dziubaltowska E., Wyszynska K., Natarajan A.T., Nilsson R. (2003). Genotoxic effects of occupational exposure to lead and cadmium . Mutat. Res. 540 , 19–28;
- Томилин Н.В., Петров А.Н., Филько О.А., Храброва А.В., Соловьева Н.Е., Иванова Т.М. и др. (2015). Оценка степени повреждения ядерной ДНК в клетках периферической крови людей, профессионально связанных с действием тяжелых металлов . Организация здравоохранения . 16 , 383–392;
- Оценка генотоксических свойств методом ДНК-комет in vitro : Методические рекомендации . М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010.- 16 с.
Проведено изучение показателей фрагментации ДНК методом ДНК-комет в щелочной модификации в условиях разного уровня воздействия радиационного фактора в бытовых условиях. Проведен учет объемной активности (ОА) радона, мощности амбиентной эквивалентной дозы (МАЭД) гамма-излучения и плотности потока бета-излучения. Среднее значение ОА радона в воздухе помещений составило 89,4 Бк/м3, значение МАЭД гамма-фона составило 0,12 мкЗв/ч, плотность потока бета-излучения 0,6 с-1. Средний уровень фрагментации ДНК составил 3,48%. Уровень фрагментации ДНК по 3 показателям (доля ДНК в хвосте кометы, длина хвоста кометы, момент хвоста кометы) был повышен у мужчин, но данная тенденция не достигала статистической значимости. Показатели ДНК-комет не отличались значимо в зависимости от изменения уровня радона. Была обнаружена положительная корреляция показателей ДНК-комет с увеличением мощности гамма-излучения. При этом МАЭД гамма-излучения находилась в пределах допустимых норм во всех обследованных помещениях.
ионизирующее излучение
днк-кометы
щелочная модификация днк-комет
эффекты низких доз облучения
1. Robertson A., Allen J., Laney R., Curnow A. The cellular and molecular carcinogenic effects of radon exposure: a review // Int. J. Mol. Sci., 2013, vol. 14, no. 7, pp. 14024-14063.
2. Druzhinin V.G., Sinitsky M.Y., Larionov A.V. et al. Assessing the level of chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes in long-term resident children under conditions of high exposure to radon and its decay products // Mutagenesis, 2015, vol. 30, pp. 677–683.
3. Singh N.P., McCoy M.T., Tice R.R., Schneider E.L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells // Exp. Cell Res., 1988, vol. 175, pp. 184–191.
4. Azqueta A., Gutzkow K.B., Brunborg G., Collins A.R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions // Mutat. Res., 2011, vol. 724, no. 1–2, pp. 41-45.
5. Konca K., Lankoff A., Banasik A. et al. A cross platform public domain PC image analysis program for the comet assay // Mutation Research, 2003, vol. 534, pp. 15-20.
6. Glantz S.A. Primer of Biostatistics / S.A. Glantz. – McGraw-Hill Medical, 7 edition, 2011. – 320 p.
7. Georgakilas A.G., O’Neill P., Stewart R.D. Induction and repair of clustered DNA lesions: what do we know so far? // Radiat. Res., 2013, vol. 180, pp. 100–109.
8. Kaur S., Sangeeta, Galhna K.K., Gautam N. Assessment of radiation induced DNA damage in human peripheral blood lymphocytes using COMET assay // Int. J. Life Sci. Scientifi. Res., 2017, vol. 3, no. 4, pp. 1208-1214.
9. Miklos M., Gajski G., Garaj-Vrhovac V. Usage of the standard and modified comet assay in assessment of DNA damage in human lymphocytes after exposure to ionizing radiation // Radiology and Oncology, 2009, vol. 43, no. 2, pp. 97-107.
10. Batar B., Guven M., Baris S. et al. DNA repair gene XPD and XRCC1 polymorphisms and the risk of childhood acute lymphoblastic leukemia // Leuk. Res., 2009, vol. 33. pp. 759–763.
11. Jiang J., Zhang X., Yang H., Wang W. Polymorphisms of DNA repair genes: ADPRT, XRCC1, and XPD and cancer risk in genetic epidemiology // Meth. Mol. Biol., 2009, vol. 471. pp. 305–333.
12. Larionov A.V., Sinitsky M.Yu., Druzhinin V.G. et al. DNA excision repair and double-strand break repair gene polymorphisms and the level of chromosome aberration in children with long-term exposure to radon // Int. J. Radiat. Biol., 2016, vol. 92, no. 8, pp. 466-474.
13. Wojewodzka M., Kruszewski M., Iwanenko T. et al. Lack of adverse effect of smoking habit on DNA strand breakage and base damage, as revealed by the alkaline comet assay // Mutat. Res., 1999, vol. 440, pp. 19–25.
14. Geric M., Gajski G., Orescanin V., Garaj-Vrhovac V. Seasonal variations as predictive factors of the comet assay parameters: a retrospective study // Mutagenesis, 2017, doi:10.1093/mutage/gex023.
Воздействие радона хорошо изучено в диапазоне высоких концентраций. Установленные гигиенические нормативы предусматривают уровень эквивалентной равновесной объемной активности (ЭРОА) в 200 Бк/м3 как границу допустимой объемной активности радона в воздухе жилых помещений. В то же время в ряде стран допустимый уровень увеличен до 400 Бк/м3, что объясняется, прежде всего, геологическими особенностями территории. С другой стороны, существует точка зрения о необходимости снижения допустимого уровня до 2 пКю/л, что соответствует 74 Бк/м3. В рамках современной парадигмы ВОЗ и принципа линейного беспорогового увеличения радиационных эффектов даже небольшое радиационное воздействие приводит к увеличению риска возникновения стохастических эффектов (прежде всего онкозаболеваний).
Очевидно, что небольшие радиационные эффекты, воздействующие на большие группы людей, могут приводить к социально значимому увеличению частоты онкологической заболеваемости . Вследствие этого представляется крайне актуальным накопление информации об эффектах действия различных типов ионизирующего излучения в малых дозах, которому подвержено в той или иной степени все население планеты. Увеличение ЭРОА радона выше 200 Бк/м3 признается нежелательным для большинства принятых нормативов в области радиационной гигиены. В то же время лишь 5-10% жилых помещений можно отнести к помещениям с таким уровнем воздействия. Уровень объемной активности (ОА) радона в 2 пКю/л (74 Бк/м3) и выше может отмечаться в 20-50% жилых помещений в зависимости от типа застройки и географического расположения. Очевидно, что даже малоинтенсивное воздействие радона может приводить к значимому увеличению заболеваемости, учитывая глобальные масштабы проблемы. Представляется актуальным исследование влияния низкодозовых нагрузок плотноионизирующего излучения на организм человека.
Радон признается в настоящее время одним из наиболее опасных канцерогенов, действующих на человека. В природе радиационный радоновый фактор не играет существенной роли, поскольку газ радон рассеивается в большом объеме воздуха и достаточно быстро распадается (период полураспад Rn222=3,82 суток). В то же время жилые и технические постройки представляют собой своеобразные ловушки, накапливающие радон (до 10 крат в сравнении с открытым воздухом). Очаги выделения радона часто располагаются спорадически, радон рассматривается в качестве ведущей причины повышения частоты хромосомных аберраций в схожих экспонированных группах .
Одним из эффективных методов биомониторинга является прямая оценка степени повреждения ДНК в клетках крови методом «ДНК-комет» (гель-электрофорез отдельных клеток). Данный метод предусматривает лизис клеток, помещенных в агарозный гель, при этом ДНК мигрирует в электрическом поле. Клетки с увеличенной частотой двойных разрывов характеризуются увеличением миграции ДНК к аноду. В 1988 году в работе Singh и коллег была предложена щелочная модификация метода, включающая этап лизиса при рН>13 . Данная версия значительно повышает чувствительность метода, позволяя выявлять одиночные разрывы, щелочелабильные сайты, сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок, а также сайты незавершенной репарации . Поскольку для большинства генотоксикантов преобладают эффекты одиночных разрывов ДНК, щелочная модификация метода позволила существенно увеличить информативность и чувствительность теста. Одно из главных преимуществ - возможность выявить генотоксическое воздействие в условиях одновременного действия цитотоксических факторов, которые приводят к формированию хромосомных нарушений, но не обладают генотоксическим действием. В условиях рН>12 ДНК денатурирует, и нити расплетаются вследствие разрушения водородных связей между 2 спиралями. При достижении рН 12,6 щелочелабильные сайты, например апуриновые/апиримидиновые сайты, трансформируются в одиночные разрывы ДНК. При рН>13 достигается максимальная степень трансформации щелочелабильных сайтов.
Материалы и методы
Характеристика выборки
Каждый обследованный заполнял персональную анкету, включавшую информацию о возрасте, состоянии здоровья, употреблении табака и алкоголя, производственных вредностях, рентгенодиагностических процедурах, авиаперелетах, прививках и приемах лекарственных препаратов в течение 3 месяцев, предшествующих обследованию. Была отобрана группа из 39 обследованных, не подвергавшихся потенциально генотоксическим факторам. Все обследованные были не старше 40 лет. Всего было обследовано 18 мужчин (средний возраст 29 лет) и 21 женщина (средний возраст 31 год).
Исследование проводили в соответствии с требованиями Комиссии по этике Кемеровского государственного университета, протокол исследования утвержден на заседании Комиссии № 4 от 10.10.2016 г. Каждый участник подписывал форму информированного согласия, содержащую информацию о целях исследования.
Образцы биоматериала
Образцы венозной крови собирались в вакуумные пробирки емкостью 4 мл, содержащие натрий-ЭДТА в качестве антикоагулянта. Сбор материала происходил в период с ноября 2016 г. по апрель 2017 г. В течение 1-2 часов образцы переправлялись лабораторию. Все образцы кодировались и обрабатывались. Выполнение метода «ДНК-комет» начиналось немедленно после поступления образцов.
Гель-электрофорез отдельных клеток (метод «ДНК-комет»)
Метод «ДНК-комет» выполнялся в щелочной модификации, разработанной Singh с коллегами . Первый слой геля представлял собой 1% раствор стандартной агарозы (Applichem, США). Для нанесения клеток использовали 1% агарозу с низкой температурой плавления (low melting point agarose, Applichem, США) при 39 °С. 70 мкл взвеси клеток крови в легкоплавкой агарозе вносили на стекло со стандартной агарозой и помещали на лед до полного застывания геля. После застывания стекла помещали в лизирующий буфер при температуре 4 °С на 12 часов. Состав лизирующего буфера: 2,5 моль/л NaCl («Вектон», Россия), 0,1 моль/л Nа2ЭДТА («Вектон», Россия), 1% Тriton Х-100 (Amresco, США), 10% ДМSO («Вектон», Россия). После лизиса проводился горизонтальный электрофорез (300 мА, 25 В, 30 мин.) в щелочном буфере (pH>13). Электрофорезу предшествовала 20-мин. обработка щелочным буфером (300 мМ NaOH («Вектон», Россия), 1 мМ Nа2ЭДТА («Вектон», Россия). Лизис и электрофорез проводился при 4 °С при отсутствии прямых солнечных лучей. После электрофореза стекла троекратно нейтрализовали в фосфатно-солевом буфере PBS рН 7,5 (Amresco, США). После этого стекла обрабатывались 70% этанолом в течение 5 минут. Препараты высушивались и окрашивались 50 мкл однократного SYBR GREEN («Биотех-Индустрия», Россия).
Анализ «комет»
Оценка параметров фрагментации проводилась путем микрофотографирования препаратов, окрашенных SYBR GREEN, с помощью микроскопа Zeiss Axio Imager 2. Всего фотографировалось 100 случайно отобранных комет от каждого исследованного образца при увеличении х400. Последующая обработка фотографий проведена с помощью комплекта ПО CASP . Рассчитывались параметры длины хвоста кометы, момента хвоста, а также доля ДНК в хвосте кометы.
Статистические методы
Статистический анализ данных проводили с использованием пакета Statistica 10.0. Для количественных показателей рассчитывались средние значения и пределы 95% доверительного интервала (CI 95). Сравнение групп выполняли с использованием U-теста Манна-Уитни. Степень значимости была принята на уровне 5%. Корреляцию между показателями для случая непараметрических данных рассчитывали с использованием коэффициента корреляции Пирсона для рангов. При этом для выборок более 50 человек также рассчитывали значение критерия Стьюдента, основанное на значении коэффициента корреляции Пирсона .
Результаты
Доля ДНК в хвосте кометы не превышала 15%. Среднее значение объемной активности (ОА) радона в воздухе помещений составило 89,4 Бк/м3, значение МАЭД гамма-фона составило 0,12 мкЗв/ч, плотность потока бета-излучения 0,6 с-1. Уровень фрагментации ДНК по 3 показателям был повышен у мужчин, но данная тенденция не достигала статистической значимости (табл. 1).
Таблица 1
Показатели фрагментации ДНК у обследованных мужчин и женщин
В качестве граничного уровня ОА радона в воздухе был выбран уровень 74 Бк/м3, соответствующий 2 пКю/л воздуха. Средняя ОА радона составила 47 Бк/м3 в первой группе и 143 Бк/м3 во второй группе. Наибольшая информативность была установлена для показателя момента хвоста комет. Момент хвоста был повышен в группе с более высоким уровнем радона, но эта тенденция не достигла уровня статистической достоверности (табл. 2). Данная тенденция характерна только для обследованных мужчин.
Таблица 2
Показатели фрагментации ДНК в группах, дифференцированных по полу и ОА радона
ОА радона в воздухе помещений, Бк/м3 |
% ДНК в хвосте кометы |
Длина хвоста, мкм |
Момент хвоста кометы |
|
3,65 |
13,73 |
0,94 |
||
3,97 |
14,52 |
1,43 |
||
3,30 |
13,21 |
0,88 |
||
3,00 |
11,95 |
0,72 |
||
3,43 |
13,42 |
0,90 |
||
3,51 |
13,30 |
1,09 |
Также была исследована возможная зависимость показателей ДНК от величины МАЭД гамма-излучения в жилых помещениях. Для проверки был рассчитан коэффициент корреляции между показателями повреждений ДНК и МАЭД гамма-излучения. Была обнаружена положительная корреляция показателей ДНК-комет с увеличением мощности гамма-излучения (рисунок). При этом МАЭД гамма-излучения находилась в пределах допустимых норм во всех обследованных помещениях.
Зависимость показателей фрагментации ДНК от МАЭД гамма-излучения в жилых помещениях (r - коэффициент корреляции Спирмена, p - вероятность «нулевой» гипотезы)
Обсуждение
Радиационное воздействие
Ионизирующее излучение способно индуцировать образование кластеров повреждения ДНК, что реализуется в форме двухцепочечных разрывов и другими повреждениями, расположенными компактно. Редко- и плотноионизирующее излучение вызывает примерно одинаковое количество отдельных ДНК-поражений на единицу поглощенной дозы, но в случае с плотноионизирующим излучением (альфа-частицы) эти поражения распределены в меньшем количестве участков ДНК, что подразумевает увеличение числа повреждений в кластере; например, среднее число повреждений по кластеру, как правило, увеличивается с увеличением линейной передачи энергии . Гамма-излучение, зафиксированное в местах проживания всех обследованных, не превышает регламентированных фоновых значений. Изменения гамма-фона, скорее всего, были вызваны особенностями строений и строительными материалами.
Анализ «комет»
Метод «ДНК-комет» представляет простой и быстрый тест, позволяющий эффективно измерять уровень повреждений ДНК и репарации повреждений, следующей после экспонирования. В данном исследовании не было обнаружено значительной гетерогенности в отношении уровня повреждения ДНК в исследованной популяции. В ряде работ, посвященных биологической дозиметрии, ранее отмечались трудности выявления эффекта малых доз облучения . В то же время в большинстве работ исследовались группы лиц, облученных внешним искусственным источником, например персонал радиологических и рентгенологических установок.
Измерения показателей фрагментации ДНК могут отражать как индивидуальный уровень повреждений ДНК, так и способность к репарации радиационных повреждений. Ранее в ряде работ установлена способность генов репарации модулировать частоту нарушений наследственного материала . Наблюдаемая картина повреждений ДНК является результатом равновесия между нарушениями и репарацией ДНК, и низкий уровень повреждений или отсутствие выраженных корреляций может быть результатом как низкого числа повреждений, так и высокой индивидуальной эффективности репарации .
По некоторым оценкам, наибольший вклад в увеличение показателей ДНК комет для непроизводственных факторов вносят сезон года (параметры увеличены летом) и медицинское облучение . В нашей работе эти факторы не могут оказывать значимого влияния, поскольку сбор биологического материала проводился в зимний период года, а все лица, проходившие рентгеновские обследования в течение 3 месяцев, предшествующих исследованию, были исключены из выборки. Отсутствие корреляций с объемной концентрацией радона, возможно, объясняется небольшим размером выборки. В дальнейшем планируется продолжение данной линии исследования с увеличением размера выборки.
Заключение
Исследование эффектов длительного воздействия малых доз облучения представляется сложной задачей, необходимость подбора выборок и контроля сопутствующих факторов способна исказить картину. В представленном исследовании не удалось выявить статистически значимых корреляций с показателями объемной активности радона, но в то же время обнаруженные корреляции с показателями гамма-фона указывают на перспективы данного исследования. Очевидна необходимость оценки фактора эффективности репарации обследованных для исследования такого типа, это позволило бы провести дифференцировку и сравнить людей с близкими характеристиками репарации.
Конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ (№ 16-34-60069\15 мол_а_дк).
Библиографическая ссылка
Ларионов А.В., Волобаев В.П., Сердюкова Е.С. ИЗУЧЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДНК-КОМЕТ У ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ В УСЛОВИЯХ РАЗЛИЧНЫХ РАДИАЦИОННЫХ ПАРАМЕТРОВ ЖИЛЫХ ПОМЕЩЕНИЙ // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 6.;URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=27215 (дата обращения: 01.02.2020). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»